开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
课题背景：
超级细菌是具有多重耐药性细菌的总称。携带有新德里金属beta;-内酰胺酶-1( new delhi metallo-beta;-lactamase-1，NDM-1) 耐药基因的细菌是一种新型的超级细菌，能够产生一种特殊的beta;-内酰胺酶，从而能够分解beta;-内酰胺环的结构，使得目前临床使用的所有含beta;-内酰胺环结构的抗生素都失效。由于其活性中心为金属离子，属于beta;-内酰胺酶的B 型酶，又称为金属beta;-内酰胺酶［1］( MBLs) 。MBLs分为B1，B2 和B3 3个亚类，NDM-1 被归为B1 类，可水解青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类等绝大多数beta;-内酰胺类抗生素。由于NDM-1 是通过质粒介导的，其传播十分广泛，这也是携带NDM-1 耐药基因细菌的可怕之处。
研究发现，金属beta;-内酰胺酶的关键残基，尤其是与金属离子结合的氨基酸残基序列高度保守，都有1个H _H _DH.Zn2 的保守序列［3］。两个金属结合位点的亲和力是不同的，Zn1 的亲和力强于Zn2的亲和力［4］。NDM-1 活性中心较大、开放、有柔性，具有静电剖面与底物结合、释放时活性中心的重排等特点，揭示了NDM-1 广谱抗生素抗性的原因［5］。 通过产生beta;-内酰胺酶水解beta;-内酰胺环是细菌对beta;-内酰胺类抗生素产生耐药的最主要机制，也可能遵从双锌金属-beta;-内酰胺酶的作用机制。它的活性可以被离子螯合物EDTA、菲咯啉或巯基类化合物所抑制，却不能被常见的beta;-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦所抑制［2］。由于目前尚无有效的NDM-1抑制剂可用于临床，NDM-1 抑制剂的研究也成为一大热点。
通过与其他的MBLs 相比较，NDM-1 中Tyr229 与Lys125 在稳定活性中心中起了十分重要的作用:Tyr229 与顶部以及底部附近的残基具有广泛的疏水交联作用; B1 类MBLs 的Loop6 包含3 个重要的锌离子配体: His120，His122 和Asp124。残基Lys125 通过氢键把Loop6 和N 端beta;-sheet 连接起来，保护了Loop6 的柔性且稳定了3个锌离子配体的构象［3］。目前提出的NDM-1的水解机制是Zn1 和Zn2 之间通过一个水桥( OHbr) 连接彼此，在反应过程中，Zn2 先结合一个水分子; OHbr 则充当亲核试剂攻击beta;-内酰胺环的羰基碳原子，同时，负电荷转移至羰基氧上。原来的beta;-内酰胺环变成一个带负电荷的四面体中间物。Zn2 结合水分子后呈路易斯酸性，为beta;-内酰胺环C-N 键的断裂提供质子( 跟其他B1 类如VIM-2 相比，NDM-1 的loop10 富含带正电荷的赖氨酸区，这可能为N原子的质子化提供了帮助) 。产物释放之后，Zn2 结合的OH-会与Zn1 结合，成为连接两个锌离子的桥梁OHbr。可能在产物释放前，水桥已重新装载，这意味着NDM-1 水解头孢噻吩的限速步骤应该是C-N 键断裂后N 的质子化而不是亲核试剂的重新装载［2］。Zn2 对于稳定底物带负电荷的氮原子很重要，Lys211 带正电荷的侧链与底物羰基的静电作用可能为催化提供了驱动力［6］。Thomas 等［7-8］的研究发现: NDM-1 的活性中心位于loopL3 和loopL10 形成的小沟裂缝底部，其水解活性依赖于2 个Zn2 离子，结合紧密的锌被称为Zn1，结合较为松散的锌被称为Zn2，2个Zn2 位于活性中心部位，Zn1 的晶体结构是一个由3 个互相协调的组氨酸残基( His120，His122 和His189) 和1 个溶剂分子共价结合构成的四面体，而Zn2 是1 个由3 个氨基酸( His250，Cys208，Asp124) 、1 个水分子和1 个溶剂分子( 甘油) 共价结合构成的扭曲的三角双锥体，其作为Zn1的配位体发挥作用［9］
发现和研制NDM-1 的抑制剂，并将其与beta;-内酰胺类抗菌药物联用，极有可能使由于NDM-1 所导致的耐药问题得到解决。已经报道的NDM-1 抑制剂的筛选方法主要包括基于蛋白酶活性测定的体外酶抑制剂筛选、基于全细胞的表型筛选以及基于蛋白结构的计算机虚拟筛选。研究发现天然产物具有污染小、过敏反应少、毒副反应小和不易产生抗药性等特点，能够克服抗生素滥用带来的医源性感染的缺点。例如清开灵注射液主成分提取液板蓝根、金银花栀子等各种药物提取液进行了耐药菌的抑菌效果测定，结果显示各药物抑菌效果明显[10]。天然产物在抗菌方面的奇特功效，是NDM-1抑制剂开发的新的希望。
本课题通过寻找对NDM-1耐药酶或突变体Y229W具有抑制作用的天然产物，以期许发现新的针对NDM-1的有效抑制剂，并期待能够通过进一步研究使其开发成临床药物。目前拟解决的问题有寻找合适的天然产物；Y229W的蛋白表达纯化问题；如何测定抑制剂对蛋白酶的活性影响及机制分析等。我们目前采用的研究手段包括通过IPTG诱导及SDS-PAGE验证Y229W蛋白是否表达；通过动力学测定酶活以及头孢呋辛MIC测定，分析数据验证抑制剂对本课题蛋白Y229W抑制作用的有效性等。
实验设计方案：
1、通过文献检索查找合适的天然产物或合成相关结构类似物。
2、NDM-1金属酶及其突变体Y229W蛋白的获得
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
