1. 课题目的及意义
白细胞分化抗原CD24（Cluster of differentiation 24）是一种糖基化磷脂酰肌醇（GPI）锚定膜蛋白，具有多个N-或O-连接的糖基化位点和P-选择素结合位点，在肝癌、结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌等多种肿瘤细胞中过表达[1]。其中，肝癌细胞过度表达CD24的mRNA与p53突变及癌细胞的低分化显著相关[2]。CD24分子作为肝癌等肿瘤细胞表面重要的标记物，存在着被开发为分子靶标的潜力。
在肿瘤细胞表面，CD24分子锚定于细胞膜表面Src家族酪氨酸激酶的脂筏结构上，通过与Src的相互作用使激酶活化以促进促进局部粘着斑复合物的形成，从而加快桩蛋白和局部粘着斑激酶的磷酸化，增强整合素介导的细胞间粘附作用。活化的Src激酶可以促进STAT3分子Y705位点磷酸化，使STAT3进入激活状态，激活的STAT3形成二聚体在细胞核内起到转录因子的作用。STAT3二聚体与DNA结合后，使其下游特定基因表达发生变化，致使细胞的生存、增殖发生改变，从而对肿瘤细胞的致癌性产生影响[3-5]。同时，CD24作为P选择素的一种配体，两者相互作用促进肿瘤细胞附着于内皮细胞并促进其与血小板的粘附，从而加速肿瘤的迁移与发展[6]。
目前使用最为广泛的CD24的单克隆抗体(Monoclonalantibody, mAb)为SWA11，具有良好的靶向性和体内外抑制肿瘤细胞增殖侵移的能力[7,8]。本实验室也通过杂交瘤技术获得了拥有自主知识产权的CD24的单克隆抗体G7mAb，但是目前急待解决的问题在于不论是SWA11还是G7mAb均为鼠源抗体，存在抗体在人体内半衰期短，对人免疫原性强，易产生人抗鼠抗体反应（Human anti-mouse antibody, HAMA）的缺点。故对抗CD24鼠源单克隆抗体进行人源化改造，以构建效果更好，免疫原性更低的人源化抗CD24抗体，成为打破抗CD24抗体临床使用的瓶颈的关键所在。
本课题以生物信息学为手段构建抗CD24人源化抗体G7hAb，即应用MOE(Molecular operating environment)技术拟合出G7cAb可变区的三维结构，基于构象分析寻找重要氨基酸残基并将其分类排序：1.位于重链和轻链可变区结合界面上的残基，对于两个结构域的装配起到关键作用；2.靠近CDR区并且包埋于蛋白内部的残基；3.与CDR区有直接相互作用的残基，相互作用包括：疏水相互作用/氢键/盐桥。然后，将鼠源的FR区与人源可变区数据库中的FR区进行匹配，并按照FRCDR经典氨基酸残基的相似度进行排序，选择为匹配的人源FR区进行替换，产生完全CDR移植的人源化抗体。最后，根据经典氨基酸残基的分析，将人源FR区的某些经典氨基酸残基进行回复突变优化。大量表达纯化人源化抗体，并对其亲和力进行评价，从而获得安全、稳定的人源化抗体。为以后CD24抗体的临床应用，以及抗体偶联药物（Antibody drug conjugate, ADC）的研发奠定基础。
2. 研究方法
本课题以抗CD24嵌合抗体G7cAb为基础，运用CDR移植技术将鼠源的FR区替换为人源的FR区，进行人源化改造。为了减少因抗体空间构象变化引起的亲和力下降，我们通过生物信息学的手段模拟出G7cAb可变区的三维结构，并分析对构象有重要决定作用的经典氨基酸残基，在人源可变区数据库中搜索匹配的FR区模板，并进行移植替换，再将经典氨基酸残基进行回复突变，进而获得优化的人源化序列。通过基因工程手段将目的基因整合至表达载体pMH3和pCApuro上，利用电转技术将含有目的基因的质粒转染入CHO-S工程细胞中，经过筛选获得表达量稳定的细胞株。大量表达人源化抗体，使用流式细胞仪和Biacore X100对几种人源化抗体进行亲和力分析，筛选获得高亲和力的G7hAb。
3. 实验内容
3.1通过生物信息学技术对抗CD24嵌合抗体进行人源化改造
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