PPARγ过表达对肝细胞中胆固醇的合成以及分解的调节作用文献综述

 2022-12-30 16:01:31

开题报告内容:(包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述,不少于2000字)

拟解决问题

PPARgamma;通过调节相关基因的表达,在脂肪形成及调节糖脂代谢过程中发挥重要作用,并与多种疾病如肥胖症、糖尿病、代谢综合征、非酒精性脂肪肝的发生、发展密切相关,而这些疾病同时又是胆固醇结石发生的高危因素。本实验在体外培养人正常肝细胞(L02),利用Lipofectamine2000转染pcDNA3.1-PPARgamma;质粒,使PPARgamma;在L02细胞中过表达,采用Western blot和RT-PCR技术检测PPARgamma;过表达对目标基因表达的影响,并通过ELISA测定细胞内胆固醇的水平,探究PPARgamma;对体外胆固醇生物合成和分解的影响及其机制。

文献综述

胆固醇结石病(CG)是临床上常见疾病之一,是胆结石病最常见的形式。在西方国家发病率达10%-20%,我国胆固醇结石发病率达8%-10%,并且随着饮食结构的改变、生活水平的提高,其发病率呈逐年上升的趋势[1]。腹腔镜胆囊切除术(LC)普遍成为治疗胆结石的手段,但存在术后腹腔内出血、皮下气肿、胆漏及胆管损伤等并发症的可能,因此通过对胆固醇结石成因及发病机制的进一步研究,以对胆固醇结石进行有效的预防及治疗,无论在社会效益或经济效益都尤为重要。目前被证实诱发胆固醇结石形成的因素主要包括以下四个方面[2]:(1)促使胆汁中胆固醇过饱和的因素;(2)促进胆固醇析出及结晶核心形成的因素;(3)抑制胆囊基础功能的因素(浓缩、吸收作用及分泌功能等);(4)抑制胆汁酸肝肠循环的因素。胆汁中胆固醇的过饱和可能是由高胆固醇饮食或肝胆固醇分泌过多引起的。胆固醇不溶于水,但在人体胆汁中与胆汁酸、卵磷脂形成微胶粒呈溶解形态,如果三者的相对比例关系发生改变,可导致胆固醇结晶析出。鉴于胆固醇过饱和是胆固醇结石形成的首要发病条件, 脂质代谢异常尤其是胆固醇代谢异常是胆固醇结石病的基础,因此探索胆固醇及胆汁酸盐代谢在肝脏、胆囊与小肠多个环节的变化, 对胆固醇结石发病机制的认识有重要意义。

胆固醇生物合成的原料是乙酰辅酶A,它的合成过程复杂,有近30步酶促反应,其中,SREBP-2和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶在胆固醇的从头合成中起重要作用[3-5]。固醇反应元件结合蛋白(SREBP) 有两种形态,SREBP-1和SREBP-2;SREBP-1主要参与脂肪合成,SREBP-2主要参与胆固醇合成,在胆固醇的代谢过程中具有重要的调控作用。Amlie Rodrigue-Way的研究表明,SREBP-2可促进HMG-CoA还原酶(HMGCR)的表达[6],HMGCR是内源性胆固醇合成的关键限速酶,它催化HMG-CoA转化为甲羟戊酸,甲羟戊酸作为合成前体参与胆固醇的生物合成。在转录水平上,HMGCR mRNA含量主要受到SREBP的调控;在翻译后水平上,HMGCR蛋白主要受到泛素-蛋白酶体途径的调节,蛋白酶体抑制剂可阻断甾醇诱导的HMGCR降解[7]。胆固醇在肝脏中转变成胆汁酸是机体排出胆固醇的主要途径,人体内大约50%的胆固醇是通过转变成胆汁酸排出体外的,此途径在维持体内胆固醇的代谢平衡中具有重要作用。胆固醇7alpha;羟化酶(CYP7A1)参与胆汁酸及内源性类固醇的生物合成,是肝脏胆固醇转化成胆酸的关键限速酶[8],催化胆固醇在肝脏分解为胆汁酸,属肝脏特异性微粒体细胞色素P450酶系。

过氧化物酶体增殖物激活受体gamma;(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma;,PPARgamma;)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员,PPARgamma;是依赖配体激活的转录因子,PPARgamma;与配体结合后被激活,被激活的PPARgamma;与视黄醛 X 受体alpha;(retinoid X receptor alpha, RXRalpha;)结合形成异二聚体,再结合于特异性DNA序列而使靶基因活化,此序列称为 PPAR 特异性反应元件(peroxisome proliferator response element,PPRE)[9,10]。目前,已知PPARgamma;在脂肪细胞生成、糖脂代谢以及炎症等多种生物学过程中发挥关键作用。PPARgamma;的合成配体(激动剂)可以改善机体的胰岛素抵抗,降低血糖水平,减少炎症的发生,因而被广泛应用于糖尿病、高血脂、动脉硬化、肥胖和氧化应激等疾病的临床治疗中,而这些疾病同时又是胆固醇结石发生的高危因素。目前已有文献证明激动PPARgamma;可降低胆固醇结石的发生率[11]。在哺乳动物中,肝脏是胆固醇体内平衡的关键器官,HMGCR和CYP7A1是肝脏内胆固醇合成和分解的关键酶[12,13]。此外,胆固醇代谢受到一些反馈机制的严格控制,例如SREBP-2[14-16]。因此,本实验拟研究PPARgamma;过表达对体外胆固醇生物合成和分解的影响及其机制,确认PPARgamma;过表达对HMGCR、SREBP-2和CYP7A1表达的调节作用,确立PPARgamma;作为防治胆固醇结石的新靶标。

试验方法

1. 体外培养人正常肝细胞(L02)。

2. 构建pcDNA3.1-PPARgamma;重组真核表达质粒,利用Lipofectamine2000转染pcDNA3.1-PPARgamma;质粒,使PPARgamma;在L02细胞中过表达。

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