文献综述
本课题主要探索如何使用CRISPR/Cas9技术敲除HeLa细胞中的REGgamma;基因，从而获得稳转细胞株，并对该细胞株进行细胞行为学分析。REGgamma;，也被称为PA28gamma;，11Sgamma; 或 PSME3，首次于系统性红斑狼疮患者血清中的作为 Ki 抗原的自身抗体被发现[1]。它不仅是一种协助传递遗传信息的核蛋白，还是蛋白酶体活化剂REG（11S）家族成员，该家族已被证明具有增强蛋白酶体降解蛋白底物的功能[2]。而蛋白酶体系统是真核生物中极其重要的蛋白降解系统，其与细胞内清除受损蛋白、调控细胞周期、转录、细胞应激等生命活动密切相关[3]，一旦受损，将对机体维持相对稳定状态产生影响，故其有着至关重要的作用。
目前的研究证明，REGgamma;-蛋白酶系统与人类癌症发生、发展存在某些相关性[4]。通过组织芯片和免疫组化EnVision法分析REGgamma;在某些恶性程度较高的癌症（如肺癌、肝癌等），超过半数的样本出现过表达。究其原因，根据其分子生物学研究可知，P53基因表达的蛋白质为REG家族的调节蛋白，如果发生基因突变会影响下游靶基因的表达，而这类基因在人类多种癌症中与REGgamma;高度相关。所以，P53基因对肿瘤细胞中的REGgamma;的表达的控制作用在治疗癌症发展中起着相当重要的作用[5]。
究竟REGgamma;在癌细胞的过表达与癌细胞之间有何相关？有研究显示，REGgamma;和Myc基因在癌细胞中过表达呈现正相关[6]。Myc属于编码核蛋白的癌基因，其表达产物在调节细胞生长、分化或恶性转化中发挥重要作用。多种Myc表达蛋白在转录起始点上游结合位点处有REGgamma;启动子，提醒我们REGgamma;可能对Myc蛋白的降解起负调控作用，所以在癌细胞中二者表达呈现正相关的关系[7]。所以，研究REGgamma;可作为一种新的肿瘤标记物，为研究治疗癌症提供新的方案。
但目前，关于REGgamma;的研究还不够深入。通过实验，我们仅能发现REGgamma;蛋白的过表达与多种癌细胞增殖加快、细胞周期缩短以及癌细胞的迁移能力增强有相关性[8-9]。不仅如此，科研工作者们还发现，用高脂喂养REGgamma;基因敲除小鼠，存在REGgamma;调控脂肪肝发生的关系[10]。但是，REGgamma;调控脂肪肝并不是通过控制与脂质积累相关的酶类或转录因子的表达量，而REGgamma;基因缺失小鼠的自嗜体数量明显上调则表明REGgamma;更有可能通过影响自嗜进而调控肝脏脂质代谢。通过实验发现，REGgamma;通过抑制自嗜从而调控肝脏脂质生成。而另一项研究表明，REGgamma;敲除小鼠比野生型小鼠更早衰老[11]。并且，虽然敲除小鼠可能因早衰而死，但却没有像相当一部分野生型小鼠一样因肿瘤死亡。这也说明REGgamma;-蛋白酶体系统有可能介导调节着衰老和肿瘤。除此之外，研究人员还发现在REGgamma;敲除小鼠中存在发育迟缓、体重较轻和轻微免疫学缺陷以及神经系统表型存在异常[12]。分析其活动量、运动协调能力、记忆能力、焦虑样行为以及精神分裂症样行为发现，敲除小鼠发生类似人的精神分裂症行为。
本课题使用的基因敲除方法为这几年大热的敲除方法——CRISPR/Cas9。这项于2013年正式被人们所知的基因编辑技术，比起之前的ZFNs技术和TALENs技术，这种新方法准确率更高、脱靶率更低、技术要求也较简单、操作容易以及价格低廉，因此受到研究基因编辑的科学家们的普遍好评[13]。
其实，追溯CRISPR/Cas9这项技术可到1987年，Ishino等人在K12大肠杆菌中发现了串联间隔重复序列，到2002年，这串序列被命名为成簇的规律间隔性回文重复序列（clustered
regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）[14]。后来经过研究人员更深入地研究发现，CRISPR/Cas9系统是在细菌和古细菌基因组中广泛存在的、可抵抗病毒和质粒侵入的一种免疫防御机制。
在原核生物中，这种防御机制具体表现为利用核酸酶Cas9，和crRNA和tracrRNA锚定目标DNA。这两种非编码RNA进一步变成一段单链gRNA。PAM位于基因组靶点的3rsquo;端，为Cas9蛋白识别所必要的序列。Cas9和单链gRNA是锚定在一起的，当单链gRNA识别到PAM序列前核苷酸后，便可以特异性地结合到这段特定序列上。结合以后，从PAM前大约3个碱基处切断DNA双链，仅留下一个平末端，然后通过非同源末端侵入通路修复或同源重组修复[15]。
当研究人员将其作用机制更深入地研究清楚后，短短几年，CRISPR/Cas9技术已经发展成目前为止最有魅力的基因编辑工具，被运用到多个领域。目前，该技术成功用于多种植物和动物的的基因敲除、基因插入、基因调控、基因修复和文库筛选等。在农业上它加速了农作物的改良和动物育种，在生命科学领域，已逐渐走向临床，曾有报到称，该技术成功用于体细胞的基因治疗，解除了一名1岁英国女孩受到病痛的折磨[16]。通过修饰其供体的免疫细胞，减轻了女孩病情。
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