文献综述
荧光蛋白在某种定义下可以说是革新了生物学研究——运用荧光蛋白可以观测到细胞的活动，可以标记表达蛋白，可以进行深入的蛋白质组学实验等等。特别是在癌症研究的过程中，由于荧光蛋白的出现使得科学家们能够观测到肿瘤细胞的具体活动，比如肿瘤细胞的成长、入侵、转移和新生。
最早出现的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是1962 年，Shimomura 等[1]从维多利亚多管水母( Aequorea victoria) 中分离纯化生物发光蛋白质———水母蛋白( aequorin) ，并观察到一个在紫外光下发出“非常明亮，浅绿色荧光”的副产物。1974 年，Shimomura 等［2］纯化得到了这种自发荧光的蛋白( 即GFP) 。1985 年Prasher ［3］构建维多利亚多管水母的cDNA 文库，用于克隆水母蛋白的编码基因，并得到含有GFP 片段的蛋白。1992 年Prasher 等［4］克隆到编码全长GFP 的cDNA。但直到此时人们对GFP 的应用前景还不甚了解。1994年，Chalfie 等［5］首次在原核的大肠杆菌和真核的秀丽隐杆线虫( Caenorhabditis elegans) 中表达了具有荧光性的GFP，证明GFP 的荧光产生不需要水母中特异组分的参与。同年，钱永健及其同事［6］提出GFP 中Ser65-Tyr66-Gly67 氨基酸残基形成4-对羟基苯甲基-5-咪唑啉酮［4-( p-hydroxybenzylidene) -5-imidazolinone，p-HBI］生色团发光的机制，并表明生色团的形成不需要任何酶或辅助因子的参与，而只需分子氧的存在，此后对GFP 的研究进入了高潮。
同以往常用的报告基因LacZ 、CAT 、荧光素酶基因以及其他抗生素基因相比, GFP不需加任何底物, 可以在UV 或蓝光激发下直接观察，荧光性质稳定；相对分子质量小, 对细胞无毒性；检测方便, 可直接用于活体测定；无种属特异性, 也没有细胞种类和位置的限制；不受假阳性干扰, 灵敏度高，且可制成永久标本。
其在生物学领域中也有广泛的应用，如：1）GFP 作为基因表达载体及重组病毒(细菌)的报告基因，方六荣等[7]对含伪狂犬病病毒(PRV)鄂A 株gG 全基因, PK gD 基因部分编码序列的质粒pUSK进行改造, 将通过PCR 扩增的增强型绿色荧光蛋白基因融合到gG 启动子下游, 构建了由gG 启动子控制EGFP 表达的PRV 转移载体pgG-/EGFP 。这将为下一步构建含EGFP 的PRV 突变株, 并以此作为示踪因子研究PRV 在体内的增殖与分布奠定基础。由于EGFP 编码区下游具有多个单一酶切位点, 这将为今后其他病毒基因插入PRV , 构建重组疫苗提供方便和良好的检测手段；2）GFP可以作为体内宿主与病原体相互作用的标记物。GFP 可以在多种多样的细菌病原体中表达。它产生的荧光不影响细菌进入到哺乳动物细胞, 也不影响细菌在哺乳动物中的存活。在活的哺乳动物和被感染的组织中, 可以观测到细菌产生的GFP , 它的荧光可以利用流式细胞术来检测；3）GFP在转基因动物研究中有广泛应用。GFP 在应用于制作转基因动物的前期工作中,GFP基因的表达产物极易检测, 可以单独构建包含这一报告基因的载体以检查基因构件中调控序列调控能力的强弱以及表达的组织特异性, 调控序列调控能力的强弱可通过GFP 荧光的强弱来反映(李夏等,[8]）GFP在临床诊断和基因治疗研究中的应用。采用基因工程的方法生产GFP 标记的抗原或抗体可作为一种简便、快速的免疫诊断新技术, 岳莉莉等[9]研究结果表明, 利用基因工程技术表达的GFP HBVe 抗原融合蛋白, 兼有荧光和抗原活性,实现了用GFP 等分子标记肝炎病毒抗原的目的。
随着技术的发展，现在已经从很多的海洋生物物种中克隆到了新的荧光蛋白，UnaG是第一个发现的来自脊椎动物鳗鱼的绿色荧光蛋白。日本鳗鲡( Anguilla japonica) 是日本料理的传统食材，也是我国沿海地区喜食的鱼类之一。日本鳗鱼具有长途迁徙生命周期，生长于内陆河中，在海洋中长距离游至菲律宾附近公海产卵［10]。2013 年日本ＲIKEN 脑科学研究所(RIKEN Brain Science Institute) 的科学家发现了鳗鱼肌肉的绿色荧光蛋白，并命名为UnaG［11 － 12］。与传统的绿色荧光蛋白GFP 相比，UnaG 需要一种天然的化学物质胆红素( Bilirubin)来激发其绿色荧光，且绿色荧光不依赖于分子氧，这一发现具有广泛的生物医学研究和临床检测应用前景。日本学者研究了UnaG 在临床检测未结合胆红素的应用[11]，UnaG 在蛋白荧光标记、蛋白相互作用及低氧环境如: 厌氧生物和肿瘤深层组织的蛋白标记方面也将会有广泛应用[13]。最近Erapaneedi raghu 等［14］将UnaG 基因接在HIF1 启动子后，低氧条件下低氧触发UnaG 在细胞和活体移植的肿瘤组织中均能很好的表达，结合mCherry 荧光蛋白的应用能清楚地标记处于低氧条件的细胞和最近复氧的细胞，这为肿瘤发生的分子生物学和肿瘤代谢研究提供非常理想的荧光标记手段。To Tsz － Leung［15］等根据UnaG蛋白的晶体结构将UnaG 基因分成两部分，在载体上分别与能相互作用蛋白的基因相连，当药物诱导两个蛋白相互作用时能激发出绿色荧光。目前，关于UnaG 应用研究的文章非常少，值得深入研究。
所以本课题研究UnaG蛋白的抗体制备及检测
虽然目前GFP 在很多领域内得以研究与应用, 但也有其不足之处。但随着生物技术的发展, 不断有新的发光蛋白被发现或改造, 报告基因家族在研究复杂细胞功能方面, 其作为荧光探针越来越显得重要。目前有25 种以上的发光蛋白满足不同的应用需求。另外, 现代成像系统的完善为荧光标记研究提供有力工具, 不同的光敏感相机和滤片理想地适配各种颜色蛋白, 图像分析软件也在不断开发。绿色荧光蛋白作为报告基因将在研究蛋白相互作用、分子动力学模型等方面表现出巨大优势, 并将被应用于更多的动物医学研究领域中[16]。所以我们新的荧光蛋白UnaG生理功能的研究也必将有巨大的意义。
参考文献：
［1］Shimomura O，Johnson F H，Saiga Y． Extraction，purification，and properties of aequorin，a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan，Aequorea． J Cell Comp Physiol，1962，59: 223-239．
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