文献综述
在1970年，T7 RNA聚合酶（T7 RNA Polymerase.）在被感染T7噬菌体的细胞中发现，并且发现其与宿主细胞的RNA聚合酶在生物物理和生物化学上有明显区别[1]。它是由T7噬菌体基因组编码，是一种高度特异识别T7启动子序列并且依赖DNA的5→3RNA聚合酶。T7 RNAP(T7 RNA Polymerase)可以催化单链或双链DNA T7启动子下游NTP的掺入，合成与T7启动子下游的模板DNA互补的RNA。该酶由分子量为99Kd的单一多肽链组成。它通过使用其中一条DNA链作为模板，催化游离核苷三磷酸进行聚合反应形成信使RNA[2]。T7噬菌体的基因组由Dunn等人和Moffatt等人分别在1983年和1984年完成测序,整个DNA序列由399,336个碱基对组成。T7 RNA聚合酶的编码区位于核苷酸3170和5819之间，因此T7 RNA聚合酶由883个氨基酸残基组成[3]。
现已经通过生物物理，生物化学和遗传学研究阐明了噬菌体T7 RNA聚合酶的结构特征，并且发现了酶的四种晶体结构：未复合的单亚基酶（Sousa等，1993），与其抑制剂T7溶菌酶复合的酶（Jeruzalmi等，1998），聚合酶和其启动子结合的二元复合物（Cheetham等，1999a），以及合成RNA的前三个核苷酸的起始复合物（Cheetham等，1998b）。单亚基聚合酶的晶体结构由Sousa等人以3.3A分辨率测，单亚基酶是高度螺旋的，并且螺旋中包含有规则的裂缝，其尺寸适合于容纳双链DNA模板[4]。该酶由聚合酶结构域和N-末端结构域组成，聚合酶结构域具有U形折叠，这属于所有pol I聚合酶的特征[5]。与其他核酸聚合酶类似，RNA聚合酶结构域类似于右手开放型结构，因此，它进一步分为手掌，拇指和手指三个结构域。
T7 RNA聚合酶现在已经广泛的用于科学研究当中，最常见的还是用于在真核细胞内基因的过表达以及在体外合成特异性RNA。目前最常用的过表达系统是使用携带T7 RNA聚合酶基因IPTG诱导染色体拷贝的大肠杆菌株和在T7启动子下游插入高表达基因的质粒[6]。在原核诱导表达系统中，通常我们使用的是通过Lac UV promoter和Lac operon控制的含有T7 RNA聚合酶基因片段的溶原菌株BL21，将含有T7启动子和所要表达基因的重组质粒转入其中，并用IPTG诱导T7 RNA聚合酶表达就可让目的基因表达，表达蛋白可占菌种表达总蛋白的20%以上，这项技术已经广泛的应用于科研当中。1995年和1999年我国科学家董晨和陈萍就用上述方法在T7启动子下高效表达人尿激酶原和抗人 TNF2alpha;单链抗体蛋白，其表达量分别占菌体总蛋白的18%和38%[7-8]，可见该方法具有十分可观的效果。另外，T7 启动子/ T7 RNA聚合酶的载体系统也可以应用于外源基因在哺乳类动物细胞中的表达[9]，并且通过优化，采用真核启动子CMV调控T7 RNA聚合酶的表达和在T7启动子下游插入 EMCV IRES序列这两种方法就能使该原核表达系统在真核细胞高效表达目的基因 ,且能适应不同的真核细胞环境，经过研究发现经过真核化的原核表达系统，其表达能力明显强于真核表达质粒 ,所表达的目的基因水平可达真核表达质粒自身的2-3倍。这表明由T7 RNAP与T7启动子在优化后产生的放大效应明显优于真核启动子对目的基因的直接调控[10]。除此之外，T7 RNA聚合酶还可以用来进行病毒拯救，主要是拯救一些非逆转录病毒，这些病毒在侵染宿主细胞后增殖时并不经历DNA这一阶段，所以没有办法通过DNA重组修饰技术对其基因功能进行研究，而病毒拯救工程有效克服了这一难题。现在主要的病毒拯救主要分为体外拯救和体内拯救这两种，体外拯救主要是通过反向遗传学的方法体外构建病毒的cDNA，再通过体外的RNA聚合酶来转录而得到病毒RNA，再转染进宿主细胞拯救RNA病毒；而体内拯救主要是利用表达T7 RNA聚合酶的辅助病毒或细胞系来体内制备病毒基因组RNA[11],而其中最常见的就是无痘病毒表达T7 RNA聚合酶细胞系的RNA病毒拯救体系的建立。T7 RNA聚合酶还可以介导构建CRISPR/Cas9基因编辑系统，通过构建T7启动子-sgRNA，将T7启动子-sgRNA、Cas9表达质粒以及T7 RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞，T7 RNA聚合酶催化T7启动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点处，进行切割，完成基因编辑过程[12]。T7 RNA聚合酶的应用广泛，在科研中对其他相关领域的研究做出了很大的贡献。
最后，本实验除了研究T7 RNA聚合酶的功能外，还涉及到了酶的原核表达及蛋白纯化技术。首先，原核表达是将克隆过的基因插入到合适的表达载体中转化进入到相应的菌体中，最后通过IPTG等去诱导并表达出目的蛋白，我们通常是使用大肠杆菌来作为宿主菌。大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌 , 它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉 , 可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，所以它广泛的应用于实验当中，常用的大肠杆菌主要是DH5alpha;和BL21这两种[13]。蛋白纯化技术则主要是通过蛋白质的特性，从其分子的带电性质，溶解度，分子大小以及配体特异性四个方面，对蛋白质纯化的方法进行研究[14]。总的来说酶分离纯化过程大致包括3个阶段:酶释放和粗分离过程、进一步提取提纯过程和最后的精致纯化过程[15]。
本次实验主要是通过蛋白纯化方法纯化出T7 RNA聚合酶，纯化方法与其他酶的纯化纯化方法类似，纯化出来的蛋白质可以用转录RNA的方法来验证其活性，从而可以用纯化的T7 RNA聚合酶进行接下来的实验，为以后的实验做铺垫，也可以用来研究T7 RNA聚合酶的功能，可见本次实验的意义重大。现在国内对T7 RNA聚合酶的功能及其相关研究的报道还不是很多，希望本次实验可以为之后的研究提供帮助。
附：主要参考文献：
[1]白利涛, 张丽萍. 酶及蛋白质分离纯化技术研究进展[J]. 安徽农业科学, 2012, 40(14).
[2]陈萍, 邓健蓓, 陈梅红, et al. t7启动子作用下抗人tnf-alpha;单链抗体的表达[J]. 生物化学与生物物理进展, 1999, 26(5):502-504.
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