红树林放线菌多样性及抗菌活性研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

广西茅尾海红树林根际土壤放线菌的活性研究

（一）研究背景综述：

1.红树林的生态环境：红树林生境是沿海地区潮间带海岸特有的木本植物群落，因受到周期性潮水影响，可利用的营养物质变化大，蕴藏着丰富而独特的微生物资源。已有研究表明，从红树林生境分离到了丰富多样的放线菌菌株，一些菌株能产生具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化活性的次级代谢产物。广西红树林面积 8 374 hm2, 占全国红树林面积的 38%,在我国各省中位居第 2微生物资源非常丰富。广西北部湾茅尾海拥有丰富的红树林生态资源，挖掘红树林生境中的放线菌对于海洋资源的开发具有重要意义[1]。

2.放线菌：放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。放线菌属于革兰阳性细菌，与人类的生产和生活关系极为密切，具有产生多种活性化合物的能力，包括抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂及多种酶类。目前广泛应用于临床的抗生素如链霉素、卡那霉素、丝裂霉素以及土霉素等约 70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等各种酶类、VitB12 和有机酸等。在微生物来源的活性化合物中，来源于放线菌的最多，约占45%。据估计，还有 1 万至 3 万种微生物的代谢产物的生物学活性尚未明确，而其中来源于放线菌的为5 000~10 000 种(王辂和褚以文, 2006)。此外，放线菌还可应用于污水处理、烃类发酵、石油脱蜡宜以及甾体转化等方面[2]。

3.抗生素耐药：2014年4月30日，世界卫生组织(World HealthOrganization, WHO)根据全球114个国家抗菌药物耐药监测报告，发布了迄今为止抗感染药物耐药最全面的报告《抗生素耐药：全球监测报告》。数据显示抗生素耐药的严重威胁不再是对未来的一种预测，而是世界所有地区正在发生的事件。就氟喹诺酮类药物而言，20世纪初，刚使用时耐药性几乎为零，到2014年，由于耐药，该药对很多患者已经无效 [3]。可见，发现新型抗耐药抗生素显得极其迫切 。

（二）实验目的：

以ESCAPE病原菌株检测模型，运用纸片琼脂扩散法，对实验室前期获得的广西茅尾海红树林根际土壤来源放线菌进行抗菌活性筛选，以期或得抗菌活性较高的药用微生物资源，为后期新抗生素的发现奠定基础。

（三）材料试剂及仪器

1.菌株：从广西茅尾海红树林根际土壤分离的放线菌。

2.试剂：培养基原料，琼脂，乙酸乙酯（分析纯），甲醇（分析纯），丙酮（分析纯），甲醇（色谱纯）

3.指示菌：罗伦隐球菌（S）,白色念珠菌（S），粪肠球菌（S），粪肠球菌（R），金黄色葡萄球菌（S），金黄色葡萄球菌（R），肺炎克雷伯氏菌（S），肺炎克雷伯氏菌（R），鲍曼氏不动杆菌（S），鲍曼氏不动杆菌（R），铜绿假单胞菌（W），铜绿假单胞菌（Q），大肠埃希菌（S）大肠埃希菌（R）; S代表敏感菌株。R代表耐药菌株。

4.培养基：ISP2培养基

（四）试验方法和操作过程

1放线菌的分离

红树林土壤样品：采集于广西北部湾茅尾海红树林植物根部10厘米左右土壤样品共计8份，装于无菌密封袋中，4℃低温保存并迅速带回实验室处理。

2 放线菌的鉴定

2.1 放线菌基因组 DNA 提取

对分离纯化典型放线菌菌落进行基因组 DNA 提取，所得的 DNA 经电泳后在 150kb 以上

的位置可见明显的条带，这些条带符合放线菌16sRNA片段的大小。

2.2 分离株 16S rDNA 检测

用提取的基因组 DNA 为模板进行 PCR，可有效的扩增出 16S rDNA 基因。PCR 产物送上海生

工生物技术公司测序，成功测出 18 个样本的序列，对测出的序列进行比对[4]，确定所测放线菌菌属。

3 抗菌活性筛选

3.1发酵液的提取以及样品制备

将长势良好的放线菌接种于2瓶装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，180r/min、28℃培养7d。发酵液4400r/min离心20min后，上清液用300ml的乙酸乙酯萃取，酯相浓缩干燥后用2mL甲醇溶解备用；留取水相，挥发干燥后用2mL甲醇水溶液溶解备用；菌体用一定量的丙酮浸泡过夜，经过滤、浓缩干燥后用2mL甲醇水溶解备用。

3.2 14种病原菌检定板的制备

12株ESKAPE菌株（包含敏感株6株和耐药株6株）、白色念珠菌和罗伦隐球菌提前一天接种于斜面培养基活化。将已灭菌的琼脂培养基倒在培养皿内，每皿10 mL(下层)，待其凝固备用。将活化好的检定菌接种于装有50 mL培养基的250 mL三角瓶中， 37 ℃，180 r/min，培养12 h成菌悬液，将菌悬液以1% 的浓度加入55 ℃左右无菌培养基中，摇匀，将混有菌的培养基10 mL加到已凝固的培养基上(上层)，置于4 ℃备用。

3.2 抗菌活性的筛选

吸取上述发酵液酯相萃取浓缩液、菌丝体丙酮浸提浓缩液、发酵液水相浓缩液各60ul，分两次加到直径为6mm的圆形无菌滤纸片上，待甲醇挥干后，分别贴于鉴定平板上，同时以左氧氟沙星为阳性对照，甲醇为阴性对照，37C培养12h，观察并记录抑菌圈的大小。

（五）实验预期结果

筛选出十余株对以上14种致病耐药菌有抗菌活性的放线菌。

参考文献

[1]吴越，李小俊，陈建宏 等.广西北仑河口红树林植物根际土壤放线菌多样性及抗菌活性研究.中国抗生素杂志,2017,(2017)04:0001-04

[2]骆耐香，陈森洲 ，袁桂峰 等.广西沿海地区红树林根系土壤中放线菌的分离与鉴定.基因组学与应用生物学，2010,29(2):310-313

[3]World Health Organization(WHO). Antimicrobialresistance:global reportosurveillance[J]. Geneva, 2014, 11

学生签名：董琨 2019 年3 月9 日