选题目的意义及国内外进展
本实验旨在通过测定在不同条件下,分离纯化所得的尿酸酶活性的变化,来优化分离纯化尿酸酶的方法与控制条件。
尿酸酶(Urate0xidase,Uricase;EC173.3)是生物体内嘌呤代谢途径中的一种酶,它以氧作为受体,将尿酸中的嘌呤环打开从而氧化生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢。大多数生物体在嘌岭代谢中都产生尿酸,许多微生物能够直接将尿酸分解而排除体外,而人类缺乏尿酸酶,以尿酸作为最终产物排出。当人体内尿酸生成超过肾脏排泄,或者当肾脏处于病理状态时使正常产生的尿酸排泄受阻时,都会造成血浆尿酸显著升高,从而导致高尿酸血症[1-4]、痛风性关节炎[5]、痛风石沉积及尿酸肾结石形成等症状等疾病。
为治疗或缓解上述的各类疾病,需要降低体内尿酸水平,而目前使用的降低体内尿酸水平的药物主要分为三类:促进尿酸排泄药、抑制尿酸合成药和尿酸氧化酶[6]。其中有研究表明,尿酸氧化酶降低体内尿酸水平的幅度和速度远远优于其他药物[7]。目前,文献报道纯化尿酸酶的主要方法有硫酸铵沉淀法、离子交换法、分子筛层析和等电聚焦层析等方法[8,9],但尿酸酶活性收率仅为9%~13%。而国内外已有的从发酵产物中分离纯化尿酸酶的技术[10,11],多为从真核生物中提取获得尿酸酶,因而本实验旨在探索从原核生物中提取尿酸酶的适宜条件及方法。
研究内容
主要研究不同方法和不同条件下,对提取的尿酸酶活性的影响。包括大肠杆菌的不同破碎方法(超声破碎法、化学破碎法和溶菌酶破碎法)及其不同控制条件(时间、浓度等)对破碎效果的影响,以及层析分离等方法的优化。
方案
1.菌种培养和诱导
将筛选好的菌接种到灭好菌的LB培养基中,每瓶培养基15ml并加入10%的Amp使其终浓度为100g/ml,接种量为1%,先培养4h(视具体情况而定)后,然后加入IPTG15mu;l诱导表达6h,摇床培养。
2.菌体的预处理
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