乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤。2011年美国CA: A Cancer Journal for Clinicians杂志布的最新统计数据显示，美国2011年预计将有230480例女性罹患乳腺癌，占女性新发恶性肿瘤的30%，排名女性恶性肿瘤发病率第一位。在我国北京、上海、天津等大城市的统计显示乳腺癌同样是我国女性最常见的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势。日趋完善的筛查诊断技术已拯救了许多早期患者。同时，研究表明癌症患者死亡的病例中超过90%是癌细胞转移扩散所造成的[1]。因此，充分研究并探明乳腺癌转移扩散的机制，为将来开发具有针对性的抗肿瘤药物奠定理论基础，给更多的患者带来健康的希望。
恶性肿瘤的转移涉及侵袭、内渗、外渗和转移4个步骤。当肿瘤细胞失去细胞间黏附作用，获得迁移能力便离开原发灶，渗入内皮血管进入体循环后外渗定居于远端位点即形成转移。原发肿瘤细胞侵入周围组织进入淋巴管或血管到达远离原发肿瘤的位点，通过外渗穿过血管壁移动到周围实质组织，进而从微小转移发展到大规模宏观的继发性肿瘤形成。目前对于转移起始的发生机制有两种主要的假说：1）肿瘤干细胞假说，肿瘤细胞具有干细胞的性质即具有自我更新和形成克隆的能力；2）上皮间质转化（epithelial to mesenchymal cell transition，EMT）。EMT是指在特定的生理和病理情况下，具有极性的上皮细胞向细胞基质间自由移动的间质细胞转化的现象，上皮细胞表型的丧失和间质特性的获得是EMT发生的主要特征。上皮肿瘤细胞在接收到周围间质的信号后转化成具有间质特性的细胞从而可以从周围细胞分离，增加细胞的运动性。因此， EMT在源发于上皮细胞的恶性肿瘤的转移过程中扮演了极其重要的角色。参与EMT的一种关键分子是E-cadherin。它在多种癌症细胞中发现其表达异常[2]。E-cadherin属于Cadherin家族(Ca2 dependent cell adhesion molecules family)，另2个成员是N-cadherin与P-cadherin。该家族是对生长于过程中细胞的选择聚集有重要作用的粘附分子家族。E-cadherin分子量约为124kDa，主要分布在上皮组织中，可维持细胞间紧密连接，组织细胞的侵袭及转移扩散，是一种关键的迁移抑制蛋白。
研究显示，E-cadherin的表达可以通过不同的分子机制进行调节，如启动子甲基化以及以其他一些诱导EMT的转录因子。最新发现它还可以受到microRNA的调节。MicroRNAs(miRs)是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，约18~24nt，是越来越受关注的转录后调控(Post-transcriptional Control)网络中重要的调控因子。在一项关于乳腺癌的研究中，研究人员通过荧光素酶报告法，发现只有具有野生型3端非编码区域(3 untranslated region, 3-UTR)的CDH1 mRNA(E-cadherin基因的转录产物)可以与miR-9结合，而含有突变型3-UTR的CDH1 mRNA不行。研究人员认为当MYC与MYCN肿瘤蛋白作用于mir-9-3 locus后， miR-9在肿瘤细胞中的表达被激活。随后miR-9靶向CDH1，抑制其翻译，下调了上皮细胞粘附分子E-cadherin的表达水平，促进了EMT，提升了癌细胞的迁移与侵袭的能力。同时，该过程还激活了beta;-caenin信号通路其他研究数据显示乳腺癌细胞中miR-9的表达水平相比较正常的乳腺组织要高[3]。
研究人员在另一项关于子宫内膜癌的研究中，探索了miRs与FOXO1表达水平的关系并发现在子宫内膜癌细胞HEC1B中miR-9等microRNA表达水平很高，而FOXO1的表达受到抑制，从而推测这些表达异常的microRNA抑制了FOXO1基因的表达，导致了紊乱的细胞周期以及受损的细胞凋亡反应，最终导致子宫内膜癌的发生[4]。Forkhead转录因子是2000年才正式统一命名的一个新的转录因子家族，从1989年在果蝇中发现第一个Forkhead基因以来，目前这个家族已超过100个成员。该家族的共同特征是具有一个长110个氨基酸的保守的DNA结合结构域，称为(Forkhead box)结构域，折叠成3个alpha;-螺旋(helix 1, 2, 3)和2个翅膀状(winged)的大环结构，因此根据这一DNA结合结构域的特点又把这类转录因子叫做Forkhead/winged helix 转录因子。Forkhead 转录因子目前被分为17个亚家族，FoxA~Q，它们功能多样，有的目前尚不清楚。FOXO亚家族(The Forkhead Box O Subfamily)是一组对基因表达起调控作用的转录因子家族，包括FOXO1，FOXO3a与FOXO4。它们参与引导细胞凋亡，调控细胞周期。因此，FOXO蛋白具有抑制癌症的潜在功能。其中，FOXO1作为一种潜在的抑癌基因得到了广泛的研究，转录因子FoxO1通过结合到下游基因启动子而激活一系列重要基因来调节细胞的重要过程。它的活性可通过PI3K/Akt/PKB信号通路与乙酰化和泛素化进行调节。
这两项实验结果支持了miRNA活性的失调在肿瘤发生和发展中扮演重要角色的观点[5]。其具体的作用机制是：miRNA首先结合到核糖核蛋白(Ribonucleoprotein，RNP)，形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)，然后通过不完全的碱基互补靶向结合到目标mRNA上的microRNA作用原件(microRNA response elements, MREs)，导致转录产物的降解或翻译抑制[6,7]。单个基因通常含有多个MRE，可以与多种microRNA结合。同时，一种microRNA可以靶向多种不同的转录产物[8]，于是研究者们推测一些包含相同MRE的RNA分子，可以通过竞争性结合microRNA从而达到相互调节的目的。因此，这些编码蛋白质的RNA分子或假基因转录产物被称作竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)。许多实验结果也支持了这一假说[9,10,11,12,13,14]，如CeRNA网络系统在调节PTEN抑癌基因时发挥了重要作用[15]。
在抑制癌症的过程中，FOXO1不仅扮演了上文提到的一些传统角色，还可能还存在着未知的新角色。本课题组运用targetscan6.0、RNA22、PITA等生物信息学软件预测了miR-9能够作用于FOXO1的3-UTR中的MRE。结合前文提到的CDH1的3-UTR亦可被miR-9靶向作用这一现象，本课题组旨在研究FOXO1与E-cadherin之间是否存在ceRNA调控网络：FOXO1的转录产物通过竞争性结合miR-9，减少miR-9与CDH1的结合，从而提高CDH1 mRNA的翻译水平，即E-cadherin的表达水平，最终达到抑制乳腺癌细胞转移的效果。
实验内容：
本课题通过构建FOXO1 3-UTR过表达载体，转染乳腺癌系MDA-MB-231细胞，通过荧光定量PCR和western blot等方法研究FOXO1对E-cadherin表达水平及乳腺癌细胞转移能力的影响，进一步研究FOXO1 3-UTR能否通过RNA对话并以3-UTR调控序列为基础对转移相关ceRNAs的调控作用，为后期研究ceRNA网络提供一定基础。
预期成果：
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