开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
研究背景和立题依据：
MicroRNAs(miRNAs)是一类短小的（常为17-25nt）单链非编码内源性RNA，它广泛存在于真核细胞中，可以通过与目的mRNA结合而造成mRNA的降解或翻译抑制进行基因表达转录后的负调控。自1993年Victor Ambros[1]及他的同事在研究秀丽新小杆线虫中发现可控制线虫发育的基因lin-4以来，研究人员相继发现了多种小分子RNA，miRNA的重要性才逐渐被人们意识到。Lewis等人的研究已表明大约有5300个基因即约占人体中基因数的30%会受到miRNA的调控[2]。
miRNA起源于内源性表达转录本，而多数人类的miRNA位于编码蛋白或者非编码蛋白的mRNA转录本的内含子区域[3]。编码miRNA的基因通过RNA聚合酶Ⅱ转录，产生原始miRNA转录本（pri-miRNA），其通过与核糖核酸酶Ⅲ Drosha结合又产生60-70nt的呈发夹结构（hairpin）的miRNA前体（pre-miRNA）。接着通过输出蛋白（exportin）5进入细胞浆[4]，在这里它们被Dicer酶切割成成熟的miRNA。高度保守性、组织表达特异性和时序表达特异性是miRNA最重要的3个生物学特性。
miRNA的作用机制目前已了解的比较透彻。miRNA-RISC(RNA-induced silencing complex，RNA诱导沉默符合物)可以通过碱基互补配对的方式与靶mRNA的3UTR区的结合来行使其转录后水平调控基因表达的生物功能。在动物中，复合物中的miRNA与3UTR区不完全配对，从而阻断相应基因的翻译过程，此时mRNA的量并没有改变。在绝大多数的植物中，miRNA则可以直接和其靶mRNA形成完全互补或几乎完全互补的序列，通过诱导产生靶向 mRNA 的特异性位点的断裂来减少其表达[4]。到目前为止，通过克隆和生物信息学的方法在动物基因组中已发现1000 余种miRNA，这些miRNA与胚胎发育、器官分化、细胞生长繁殖凋亡、干细胞的维持、神经系统的发育、病毒感染有关[5-6]。
肿瘤本质上是一种多基因异常疾病。目前大量的研究已经表明miRNA与肿瘤的增殖、分化、侵袭和转移等密切相关，正常组织细胞与肿瘤细胞之间的 miRNA 的表达也具有明显差异。大多数 miRNA 的基因位于肿瘤的发生和发展过程中相关性脆性基因位点， 例如杂合性或纯合性缺失区、 断裂区或扩增区等。一般来说，miRNA对肿瘤有两方面的作用，一是可以通过抑制原癌基因而抑制肿瘤，二是可以通过抑制肿瘤抑制基因来促进肿瘤的发生[7]。其中，本课题研究的miRNA-31在恶性肿瘤的发生中起着非常重要的作用，有报道显示miRNA表达水平在头颈癌、结肠癌、肝癌和舌鳞状细胞癌等肿瘤组织中与正常组织细胞相比有很大不同[8]。
E2F转录因子是1986年由Kovesdi等作为腺病毒E2启动子的活化剂被发现的[9]，目前一共发现8个不同的E2F家族成员，即E2F-1到E2F-8。E2F转录因子家族已被证明在细胞周期调控中发挥重要作用，它们通过调节靶基因的转录来调控细胞的增殖、凋亡及分化。E2F蛋白与二聚体伙伴蛋白(dimerization partner protein,DP)结合形成有功能的异二聚体后，结合到靶基因启动子中特殊的DNA序列上来调节基因转录。根据其在细胞周期进展中的作用， E2F 转录因子可以被分为两大类，起转录激活作用的激活子和抑制转录的抑制子。 E2F2 即属于转录激活因子[10]。
研究表明E2F因子的调控方式比较复杂，其中最重要的是与Rb蛋白（视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白）的结合机制。pRb家族主要包括3个成员，分别为pRb、p107、p130，也被叫做口袋蛋白，因其内存在一个口袋结构而命名。Rb家族蛋白以非磷酸化的活性形式和高磷酸化的失活形式存在，可抑制许多哺乳动物细胞细胞周期运行。在细胞周期G0期或G1早到中期，Rb家族蛋白与E2F蛋白结合，使后者丧失转录激活作用，导致细胞进入G1阻滞期。当细胞接近细胞周期的G1末期时，pRb家族蛋白被细胞周期蛋白（cyclin）与周期蛋白依赖激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）构成的复合物磷酸化，从而引起与其结合的E2F释放，E2F蛋白由胞浆进入核内，作为核转录因子结合到靶基因启动子上来刺激靶基因转录，促进了一系列相关蛋白的表达，细胞即可实现从G1期到S期的转换，从而促进细胞的增殖。在细胞周期的S中期E2F活化靶基因后，E2F/DP复合物发生磷酸化，使E2F活性被抑制。另外，当细胞通过M期并进入到下一个细胞周期时，pRb 去磷酸化并再次结合到E2F上，再次抑制其转录活性[12-14]。
利用生物信息学软件Target Scan预测发现在E2F2mRNA中存在miR-31的结合位点。因miRNA可以抑制基因的表达而E2F2转录因子可以影响肿瘤细胞的增殖，因此可以推测miR-31可以通过抑制E2F2蛋白的表达从而抑制结肠癌细胞HCT-116细胞的增殖而达到治疗的目的。
本课题通过转染miR-31mimics 进入结肠癌细胞HCT-116进行MTT增殖实验来检测miR-31对结肠癌细胞HCT-116的增殖的影响。之后通过Western blot研究miR-31对E2F2表达的影响。随后构建含有E2F2 3UTR区的质粒，转染HCT-116细胞，通过荧光素酶报告法研究miR-31对E2F2的靶向性。本课题在miRNAs转录调控的研究中有新的突破，为抗肿瘤药物提供新的靶点，为研究结肠癌的发生发展机制及建立特异的靶向生物治疗手段提供科学依据，有着重大的科研意义。
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