课题名称 铜绿假单胞菌临床菌株产beta;-内酰胺酶的研究课题性质 ●基础研究应用课题 设计型 调研综述 理论研究 铜绿假单胞菌是临床常见的条件致病菌,当机体免疫力低下时可引起多种感染。
其产生的超广谱beta;-内酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶是目前国际上研究最为活跃的两类beta;-内酰胺酶,在铜绿假单胞菌耐药机制中起非常重要的作用,由此引起的耐药给临床治疗也带来了极大困难，使得近年来铜绿假单胞菌对人的致病作用明显增加,成为一系列严重的化脓性感染,尤其是支气管扩张、慢性支气管炎、间质性肺疾病、囊性肺纤维化等继发感染的重要致病菌。
这就迫切需要临床实验室能够及时将这两类酶的产生以及产酶菌株的药敏情况报告给临床医师,指导临床合理用药,也就是需要临床实验室能够及时的鉴别出产酶菌株的表型。
beta;-内酰胺类抗生素是治疗铜绿假单胞菌感染最常用的一类抗生素,但近年来铜绿假单胞菌对其耐药性日益严重,其耐药机制复杂,可产多种beta;-内酰胺酶。
本研究通过酸测量法、淀粉-碘测定法、头孢硝基噻吩显色反应、三维试验来研究我院分离铜绿假单胞菌产AmpC酶和ESBLs情况,检测四种方法是否可行并在此基础上比较不同方法测定的差异以及其精确度，从而提出控制铜绿假单胞菌的抗感染治疗方案,以利提高抗菌药物使用的针对性和疗效。
1、材料和方法1.1材料1.1.1试验菌株：我校微生物教研室保藏的铜绿假单胞菌，从中筛选出的多株多重耐药菌1.1.2标准品：青霉素G钾盐、药敏纸片包括亚胺培南、头孢西丁、头孢他啶、头孢他啶-克拉维酸1.1.3培养基：LB肉汤,蛋白胨,酵母抽提物,无水氯化钠,蒸馏水,调节pH至7.0,经高压灭菌后使用或储存于4℃冰箱备用1.1.4试剂配制：磷酸盐缓冲液: 磷酸氢二钾 2.0g，磷酸二氢钾8.0g，蒸馏水定容至1L，115℃高压灭菌30min1.2方法1.2.1酸测量法0.8ml5g/L酚红溶液加至6.6ml蒸馏水中,高压灭菌,临用时加人800万单位结晶的青霉素G钠.(华北制药厂,批号920947)用1mol/LNaoH液调成紫色,pH约为8.5,注意试剂易变色失效.用消毒竹签取数个新鲜菌落加于含0.1ml青霉素酚红液的微量稀释板孔中,混匀,10-15min内变为黄色为beta;-内酞胺酶阳性.1.2.2淀粉-碘测定法用pH6.0磷酸缓冲液配制青霉素悬液 6000mu;g/ml，取该液0.1 ml置于微量稀释板凹孔中，挑选检测菌株数个菌落混悬于其中，摇动30min，静置室温中1h，加淀粉液2滴，再加碘液1滴，混合，立即观察颜色变化，阳性者当加入碘液后，首先立即出现蓝色、如在10min内消失蓝色，提示该菌产生beta;-内酰胺酶。
1.2.3头孢硝基噻吩纸片法液体方法：10mg头孢硝基噻吩溶解于lml的二甲基亚砜中，然后用0.1mol/L PBS(pH7.0)再稀释 1：20，最后浓度为500mu;g／m1，溶液呈黄或淡橙色，保存4～10℃，可用几个星期。
取该溶液0.05ml置放于微量稀释板凹孔中或小试管中，挑取 被试菌落，制成浓厚悬液，与凹孔中基质液混和，室温10～ 30min，头孢硝基噻吩由黄变成红色为阳性，若显色不明显，观察可延长6h。
1.2.4三维试验1.2.4.1、制备beta;-内酰胺酶的粗提液：挑取单个纯分菌落接种于2mlM-H肉汤中增菌18-24小时，然后吸取200ul（按下一步增菌液量的0.4%计算）菌液到含有50ml胰大豆蛋白胨水的增菌液中振荡增菌4小时，离心收集细菌，然后用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液（PH7.0）冲洗离心所获得的沉淀物后制成一定浓度的细菌悬液，再用冻融法（-70℃快速冷冻，室温或37℃水浴快速解冻，反复5次）或超声粉碎法（4℃，超声粉碎）破碎细菌细胞，使其菌体内的酶释放出来，离心收集上清液。
根据文献制备MH平板、贴药敏纸片、挖槽、向槽内加酶粗提物,35℃培养过夜,观察结果1.2.4.2、三维试验操作步骤：将铜绿假单胞菌按NCCLS的K-B法涂布于M-H平板上，在平板中央贴一张头孢噻肟纸片，从距离纸片5mm处用无菌刀片在平板的琼脂上向外缘方向（离心方向）切一裂隙（一块平板切4条裂隙，每条裂隙长15mm、宽3mm），将4条裂隙分别编号，1号裂隙中加入30ul酶粗提液、10ul液体培养基。
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