开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
1.研究意义：
1型糖尿病( type 1 diabetes mellitus，T1DM) 是由免疫介导的胰腺细胞破坏引起的自身免疫性疾病，这种破坏受机体免疫系统的调节，导致胰岛素的产生和分泌受到限制或完全停止。一旦发病，患者需要外源使用胰岛素[1]。根据国际糖尿病联盟( IDF)于2019 年发布的第9版《全球糖尿病地图（IDF Diabetes Atlas）》,中国的T1DM发病率和患病率均不低，15岁以下人群中，每年每千人有4.8例新发，28.7例患者，在各国中均列第4。作为自身免疫性疾病的一种，T1DM的发病机制复杂，并发症多样，针对其研究的突破可以应用于其他自身免疫性疾病的研究，因此是近十年来国内外研究的热点。
糖尿病临床以慢性长期高血糖为主要特征，在疾病后期存在胰岛素抗性而并发多种综合征，如心血管疾病、糖尿病肾病等，严重影响患者的生活质量甚至最终导致死亡。目前1型糖尿病的发病机制较为复杂且尚未完全阐明。现在临床尚无治愈1型糖尿病的方法，治疗手段除采用胰岛素注射疗法以外，胰岛移植、干细胞移植等方法也逐渐出现。但由于治疗效果与临床确诊时的残余beta;细胞功能成正相关，且糖尿病为终身性疾病，长期注射或服用药物、胰岛供应不足及排斥、干细胞移植困难等均使以上治疗方案存在局限性。故随着对胰岛细胞自身抗体认识逐渐深入，研究重点开始侧重于预防及早期诊断[2]。
在 1 型糖尿病潜在患者血清中，常能检测到针对一种或多种胰岛自身抗原的抗体，这些自身抗原包括胰岛素（Ins）或胰岛素原（PIns）、谷氨酸脱羧酶 65（GAD65）、胰岛素瘤抗原（IA2）等。使用这些自身抗原通过一定途径免疫，可以达到预防和治疗 1 型糖尿病的目的。针对这些已经发现的抗原，多种抗原特异性疫苗正在开发，以增强患者体内的免疫耐受。
在人类和NOD小鼠(最广泛使用的T1D临床前模型)上的研究发现，谷氨酸脱羧酶(GAD65)是该疾病的主要自身抗原之一。GAD65中的肽序列在人和NOD小鼠中都表现为T1D中的自身抗原,大多数糖尿病前期和新诊断T1D患者抗GAD65自身抗体或GAD65反应性T细胞(10)检测呈阳性。在NOD小鼠中，GAD65特异性T细胞反应最早可在4周龄时检测到。尽管GAD65在启动人类T1D中的作用仍然存在争议，但在NOD小鼠上进行的临床前研究表明，基于GAD65多肽或蛋白的疫苗可以预防糖尿病[3]。且Diamyd——由GAD65蛋白和明矾组合而成的疫苗已在I期和II期临床实验中取得较好的治疗效果并证实了其安全性，但在III期临床实验中治疗效果不佳。故以GAD65为基础的疫苗的有效性仍需进一步验证[4]。
将 GAD65全分子进行肽段扫描合成，每个肽段包括 20-23个氨基酸，相邻氨基酸之间有 5 个氨基酸的重叠，共计得到 38个肽段。扫描结果显示 p524-543 是最早激发 T 细胞免疫增殖的抗原肽。该肽段由两段不同的重叠决定簇组成。Quinn A 等人[5]的研究认为 p524-538 （p2）具有调节作用，而 p530-543则与胰岛最早期的浸润相关。针对p290-309 具有特异性的 Th2 细胞在 12周龄小鼠上进行过继实验能抑制小鼠疾病发展[13]。另一些研究也发现，多表位混合或串联给药，易于在已经产生 Th1 炎症性内环境的NOD 疾病鼠上产生调节作用，抑制胰腺炎进一步发展为 1 型糖尿病[14,15]。
霍乱肠毒素无毒性B亚基（cholera toxin B subunit，CTB）是霍乱弧菌主要的保护性抗原，能剌激血液和肠道产生特异性保护抗体，和别的抗原共同使用具有免疫佐剂的作用。CTB 是一种很好的口服和鼻黏膜免疫佐剂，还是一种有效的免疫载体分子。抗原分子与 CTB 结合后，与肠相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissues，GALT）细胞表面的神经节苷脂 GM1 具有较强的亲和力，这就更利于抗原的传递和免疫识别，引起粘膜免疫耐受[6-7]。实验表明，相比于单组分疫苗，将beta;细胞自身抗原与肠毒素B亚单位佐剂结合的多组分疫苗，进一步改善了抑制炎症的DC机制[8]。
鼻黏膜免疫是一种诱人的免疫途径。鼻腔呼吸区细胞表面有大量微细绒毛，具有巨大的表面积。鼻黏膜内血管丰富，大量的免疫细胞和免疫分子弥散的分布在黏膜下层及黏膜表面。此外由于鼻腔中酶的含量低，对大分子蛋白质的分解作用远低于胃、肠道黏膜，这一特点也十分有利于蛋白多肽疫苗的透过和吸收。Tian J 等人[9]使用 GAD65 肽单次滴鼻免疫 2-3 周龄的 NOD 小鼠可以诱导出高水平抗 GAD65 IgG1 抗体，抑制小鼠发生 1型糖尿病。Dylan D 等人[10]也发现，滴鼻免疫胰岛素 B9-23 与皮下注射该肽段可以达到相似的对 NOD 小鼠的保护作用。
实验通过将p217–236（p1）、 p290-306（p3）分子融合表达, 加入具有调节作用的 p524-538（p2）,即GAD65III,依次连接到CTB分子的C端后,表达纯化该蛋白并复性,对NOD小鼠滴鼻给药并在实验过程中检测相关的参数。
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