1、拟研究或解决的问题
本课题计划建立用哺乳动物细胞表达抗体的平台。与其它表达系统相比，哺乳动物细胞表达系统更有利于蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而其表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。抗体药物属于生物大分子，分子量约150 kDa，含有复杂的翻译后修饰；在进行候选抗体的筛选时，要求抗体蛋白能正确折叠、翻译后修饰稳定，因此需要建立用哺乳动物细胞表达抗体的真核表达平台。
2、采用的研究手段
本课题采用的研究手段如下：利用PCR反应扩增抗体基因；通过酶切连接的方法，将抗体基因插入到表达载体中；然后将表达质粒导入到哺乳动物细胞中进行表达；最终用Protein A对表达的抗体进行纯化，以及鉴定。
2.1 PCR扩增反应
是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3rsquo;末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2 等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5rsquo;→3rsquo;方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
2.2 载体构建
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
2.3 转染
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
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