1.选题的目的及研究意义
L-5-甲基四氢叶酸是体内叶酸的代谢产物,是体内重要的甲基供体,可参与体内多种生化反应。例如，L-5-甲基四氢叶酸是叶酸循环中的主要形式，也是同型半胱氨酸甲基化合成蛋氨酸反应的甲基供体，如果缺乏则导致体内同型半胱氨酸含量的升高,造成高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化、血栓栓塞、血管损伤的独立致病因素，并与高血脂、脑血管疾病、肾脏疾病、糖尿病、冠状动脉疾病、周围血管病、类风湿关节炎、自然流产及阿尔兹海默症高度相关。
普通叶酸只有转换为 L-5-甲基四氢叶酸才能参与甲基化过程以及DNA合成。此外,L-5-甲基四氢叶酸是人体血浆和细胞内游离叶酸存在的唯一形式也是唯一一种可以穿透血脑屏障的叶酸类药物[1-2]。它与抗癌药物甲酰蝶呤等配伍使用[3],可以降低抗癌药物的毒副作用。同时,L-5-甲基四氢叶酸也被用于巨幼红细胞性贫血的治疗。
美国、日本和欧洲已经批准将L-5-甲基四氢叶酸作为一种食品添加剂添加到各种食品中,使得L-5-甲基四氢叶酸的市场需求量剧增[4]。目前, 国内外L-5-甲基四氢叶酸的生产主要依靠化学方法合成, 以叶酸为原料, 经还原、甲基化、异构体拆分等步骤得到产物。在合成过程中产生的光学异构体D-5-甲基四氢叶酸不能被人体吸收利用[5],无治疗保健作用,且拆分工艺复杂化学合成对生产工艺的要求极高,使得生产成本也较高.需要寻找一种新方法降低生产成本,并且得到光学纯度较高的L-5-甲基四氢叶酸。生物合成途径中关键酶的过表达是代谢工程中提高代谢产物常用策略。因此本研究想通过使二甲基四氢叶酸还原酶过表达来提高L-5-甲基四氢叶酸的产量。为生物法合成L-5-甲基四氢叶酸提供一个新研究思路。
2.拟研究或解决的问题
2.1 目的基因序列的获取
通过NCBI查得目的基因二甲基四氢叶酸还原酶的目的基因序列
2.2 引物的设计
通过软件premier premier 5设计引物
2.3 PCR扩增序列
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